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黑果枸杞离体培养技术研究进展

 摘 要:黑果枸杞是我国西北地区重要的防沙固土和药用藤本植物,离体培养技术是其快速繁殖幼苗的一种重要途径。该文综述了黑果枸杞离体培养技术的研究进展,并对其在实际生产中存在的问题进行了探讨。
  关键词:黑果枸杞;离体培养;进展;问题
  中图分类号 S567.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2020)12-0020-03
  Abstract: In vitro Culture technology is an important way for rapid propagation of plant seedlings. Lycium ruthenicum is an important medicinal vine plant for sand control in Northwest China. In this paper, the main key technology of in vitro culture of Lycium ruthenicum was summarized, the research status of in vitro culture technology was analyzed, and the in vitro culture technology of Lycium ruthenicum and the problems in its practical production were discussed.
  Key words: Lycium ruthenicum; In vitro Culture; Progress; Problems
  黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为枸杞属(Lycium)小灌木,在我国主要分布在西北多地及西藏等地[1]。球形浆果、紫黑色,果实味甜多汁,富含蛋白质、微量元素、维生素等[2],食药兼用[3]。黑果枸杞提取物具有降血脂[4]、降血糖[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]、抗变异及抗肿瘤[8]等生理作用,具有较高的开发价值和应用前景。黑果枸杞具有抗旱、耐盐碱、防风、固沙和护水等生态功能[9]。因此,研究黑果枸杞具有较高的经济和生态价值。
  植物离体培养技术能够为育种、品种保存和大规模种苗生产带来可观的经济效益,具有广阔的发展空间及潜能[10],目前,在细胞生物学、遗传学、培养细胞突变体和人工种子等方面也开始发挥重要作用[11-12]。笔者对黑果枸杞离体培养的外植体选择及消毒、愈伤组织诱导、分化及不定芽增殖、生根等方面的研究现状进行了归纳及整理,以期为黑果枸杞的离体培养研究提供参考。
  1 黑果枸杞组培快繁培育的研究进展
  目前植物器官、组织及原生质体等均能培养再生植株[13]。黑果枸杞的离体快繁或植株再生大多选用4个步骤:(1)愈伤组织的诱导,通常采用叶片或茎段诱导;(2)丛生芽的分化,通过使用不同植物生长调节剂,对愈伤组织进行分化调节,得到较好的丛生芽分化体系;(3)植株的扩繁,通过筛选培养条件,优化出最佳增殖配方;(4)最后再进行生根培养。也有部分利用无菌苗叶片直接诱导再生植株的相关研究[14]。目前能查阅到较早有关黑果枸杞离体培养的文献是浩仁塔本的研究[15],他以带腋芽的嫩茎段作为材料,成功诱导出不定芽并生根移栽成活。
  1.1 外植体的选择及消毒 外植体的选择在植物离体培养中至关重要。黑果枸杞离体培养的外植体大部分采用种子播种的无菌苗。现有相关文献资料表明,黑果枸杞离体培养选择种子[16-21]、带芽茎段[15,22-24]作为外植体较为常见,但也有以叶片[14,25-26]作初代培养的初始材料。获得无菌外植体是离体培养成功的前提,不同外植体所需消毒剂和消毒时间均不相同[27]。升汞是一种常用的消毒剂,相关研究表明黑果枸杞枝条一般选用0.1%升汞,对黑果枸杞嫩枝的消毒效果较好[28],但通常会选取酒精进行灭菌前辅助消毒,灭菌时间长短应根据不同的外植体类型来确定。相关研究表明,升汞消毒时间在2.5~16min[22,28-29],相差较大的原因可能与取材的季节相关,采样时间对外植体消毒时间影响极大,为达到理想效果,夏秋消毒时间最长能达到16min[28],春季相对短一些。种子作为外植体,选用1.5%~8%次氯酸钠溶液[14,17-18,20-21]处理3~10min即可达到预期效果。
  1.2 愈伤组织的诱导 愈伤组织培养是植物离体培养常见的培养形式[30]。培养基的成分是植物组织能够正常生长的关键因素,大多数都选用MS基本培养基[15,17,23],也有在启动培养时用1/2MS和B5培养基[31]。植物生长调节物质的浓度和比例对调控培养物的生长和形态影响最大[32]。常用于黑果枸杞愈伤诱导的植物生长调节剂有2,4-D、NAA和6-BA。杨宁等[17]研究其无菌苗叶片诱导愈伤时,未添加任何植物生长调节物质的培养基亦可长出少量愈伤,但出愈率很低。李琳等[18]研究显示,2,4-D能够诱导黑果枸杞细胞脱分化,其激素比例为6-BA∶2,4-D=1∶2;曹君迈等[14]研究同样证实了上述试验结果,即添加0.4mg/L 2,4-D可以诱导叶片形成较好的愈伤组织;但也有研究显示以无菌苗叶片为外植体,可通过添加6-BA和2,4-D(激素比例为5∶1)诱导出较好的愈伤组织,但该研究特别强调较高浓度的2,4-D极易引起愈伤褐化现象[17]。愈伤诱导与外植体材料及植物生长调节剂种类和配比等直接相关[33],衰老的植株脱分化过程极其困难且容易出现褐化现象。因此,在黑果枸杞外植体诱导愈伤时,建议采用幼嫩组织进行诱导。马彦军等[31]以嫩茎为材料,发现NAA能够取代2,4-D诱导黑果枸杞嫩茎脱分化形成愈伤组织,该研究中选用的激素为6-BA和NAA,激素比例为1∶1,出愈率显著提高,达到85%。裴小鹏等[25]以青海、甘肃、西藏3地的黑果枸杞为材料,在诱导叶片愈伤时添加6-BA(0.5mg/L)及NAA(0.1mg/L),愈伤诱导率均为100%;黑果枸杞根、茎、叶15d即可诱导出愈伤组织且诱导率均高于98%;孙晓红等[26]用添加6-BA(1.0mg/L)及NAA(0.2mg/L)的MS培养基100%诱导出了叶片愈伤获得成功;乔永旭等[34]采用相同激素组合对黑果枸杞子叶、下胚轴和胚根等组织进行诱导,且在激素比例达到6-BA∶NAA=2∶1時诱导率可达到100%。由此可知,适合黑果枸杞愈伤诱导的6-BA浓度在0.2~1.0mg/L[18,26,34-35],随着NAA浓度的增加,黑果枸杞愈伤组织的生长状况越佳,但6-BA浓度过高(1.5~2mg/L)会出现玻璃化现象,愈伤组织的生长状态与植株生长调节剂直接相关。
  
  1.3 愈伤组织的分化及不定芽的增殖 在离体条件下,不同生长调节剂及浓度组合对愈伤组织分化的效果不尽相同[33]。马彦军等[31]研究表明6-BA浓度较低的条件下,细胞分化率可达到80%以上,最高可达92%。汪清锐等[19]同样使用6-BA作为细胞分化激素,40d后可从愈伤组织中获得不定芽;随6-BA浓度的上升,不定芽发生率也增加,但6-BA浓度高于一定值时,不定芽会出现玻璃化现象[35]。玻璃化现象的产生与细胞分裂素浓度有很大关系[36],当培养基中 6-BA浓度较小时(小于0.4mg/L),不定芽生长基本正常。由此可知,低浓度的6-BA有利于黑果枸杞愈伤组织分化出正常的再生植株。李小艳等[29]在讨论初代诱导芽分化的影响时,对促进细胞分裂激动素KT的作用进行了讨论,结果显示当以MS为基本培养基时,添加KT和IBA的组合可以使外植体更快启动,不定芽相较于添加6-BA和IBA激素的组合更为细弱;但是6-BA与IBA组合的条件下,芽生长的启动缓慢,长势也较为平缓。因此,可根据不同要求选择不同激素组合。陈海军等[20]通过分析发现,过低或过高的激素浓度均会抑制愈伤组织分化,添加6-BA(0.3mg/L)和NAA(0.05mg/L)最适宜分化形成丛生芽,分化率达80%。乔永旭等[34]研究了不同浓度6-BA、NAA对黑果枸杞愈伤组织分化的影响,结果显示培养35d后芽开始形成,随着6-BA/NAA比值的降低,丛生芽诱导率出现上升趋势,当6-BA和NAA浓度均为0.5mg/L时丛生芽发生时间最早,诱导芽的增殖系数最高。也有部分研究显示不添加任何植物生长调节剂MS培养基继代增殖黑枸杞效果较好,增殖系数达到8[29],这与浩仁塔本[15]、李媛媛[28]、杨宁[17]等研究不定芽增殖结果不一致。而孙晓红等[26]试验结果表明,添加1.4mg/L的ZT可以诱导叶片愈伤分化,这与以上大多数研究者研究结果均不同。分析其原因,李小艳等[29]认为在田间能通过扦插繁殖的材料,培养时对植物生长调节剂的需求量会较少或基本不需要,但大多数研究均显示单独添加6-BA,或6-BA与NAA、IBA组合有利于不定芽增殖。
  1.4 生根培养 黑果枸杞组培苗生根常用的生长素为IBA[17,24-25],但也有少数在生根培养基中混合添加IBA和NAA[19,26]或只添加IAA[37]诱导不定根。杨宁等[17]研究发现较低浓度IBA(0.2mg/L)生根率极高,可达到95%。李媛媛等[28]研究表明,当IBA浓度为0.1~0.2mg/L时,1/2MS相较于MS培养基效果更佳。马彦军等[31]将NAA和IBA进行组合得到了黑果枸杞组培苗较好的生根效果,这与汪清锐等[19]研究结果基本一致。裴小鹏等[25]研究表明添加0.2~0.3mg/L的IBA的1/2MS培养基适宜生根。由此可知,多数研究者认为1/2MS培养基添加0.1~0.3mg/L的IBA生根效果较好。
  2 问题与展望
  近年来黑果枸杞野生资源遭到破坏性采挖[14],其生存生态环境日趋恶化[[38],人工栽培黑果枸杞势在必行。虽然黑果枸杞扦插技术较为成熟[39],但扦插繁殖周期较长[24],因此,离体快繁是保护黑果枸杞野生资源的有效途径之一。当前黑果枸杞离体培养研究中的问题主要有培养继代周期偏长、研究单一化等,今后可以离体培养为基础,结合现代植物生物技术,开展黑果枸杞的植物生物技术育种,培育黑果枸杞新品种。
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  参考文献
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